《最后的晚餐》画中故事取材于《圣经》， 内容是耶稣预知他将遭逮捕并被处死，在和他的几个门徒共进最后那一次晚餐时，说道：“你们中间有一个人出卖了我。” 这话像炸弹一样，在门徒中引起了种种反应。 这微妙的瞬间就被画家达.芬奇固定在画面上了。
以往的画家总是把叛徒茹达斯一个人画在餐桌的另一边，达.芬奇却把茹达斯画在众门徒之中，但动作呈向后躲闪状，仿佛被耶稣的话击中一时不知所措，可是手中的钱袋毫不放松，里面装着卖主得来的金币。 他臂旁碰翻的盐罐说明其内心的慌乱， 他的脸部处在黑影之中， 更突出了其阴暗的心理。
再看别的门徒： 茹达斯后边的伯多禄，性情急躁，他左手放在脾气温和的若瑟的肩上， 追问叛徒是谁？ 右手拿着餐刀恨不得置叛徒于死地。 伯多禄后面的老安德肋，不由举起双手示意大家安静，听老师说出下文。 他旁边的小雅各伯，忙着拉住伯多禄， 免得他闹出来乱子。而最边的玛窦， 则沉着警觉，紧张地站起来注视着事态的发展。画面最右端的西满，他那惊讶的表情好像在说：“这怎么可能呢？” 。
而耶稣呢？ 他明知自己将成为殉道者， 却仍然那么平静、坦然，摊开的双臂似在表示：无非如此，一切都在预料中！ 他面露悲悯之情，仍在关心着人间的苦难。他的崇高、理想之美与茹达斯的卑劣形成鲜明对照。 使主题格外突出。
从构图看，画面大量的规整直线，增强了肃穆的气氛。12门徒分成四组，每组3人，又互相呼应， 严整中有着变化。特别是房屋、窗户、餐桌、地面的透视线都向耶稣集中， 消失点正在耶稣身上，突出了他的“视觉中心”地位。
《最后的晚餐》用了4年的时间才完成，仅仅为了创造茹达斯的形象，达.芬奇就去过闹市和罪犯集中之处观察、寻找典型。至于耶稣，他更是推敲再三，最后把生活中的素材加以概括并使之理想化才创造出来的。这些都使他的画有别于以往宗教画冰冷的“神性”，而向“人性”迈进了巨大的一步。
| 
